一种从污泥中提取eps的方法

技术领域

1.本发明涉及污水处理领域，特别是涉及污水生物处理领域，更为具体的说是涉及一种从污泥中提取eps的方法。

背景技术：

2.胞外聚合物( ，eps)是微生物在一定的环境条件下，代谢过程分泌的包围在细胞壁外的多聚物，eps主要包含蛋白质、多糖和核酸等聚合物，一般认为eps占活性污泥总有机质的50％～90％。eps对污泥絮体的束水容量具有重大影响，污泥中大部分的水结合在eps中，因此eps被认为是影响污泥脱水性能的最主要因素。同时，有研究表明eps中的主要成分蛋白质、糖类等的含量都与污泥体积指数(svi)成正相关，eps的存在改变了污泥表面电荷，从而直接影响了污泥的沉降性。因此，准确高效提取并定量eps对研究污泥沉降性能及污泥膨胀状况具有十分重要的意义。

3.目前现有技术中对eps的提取包括有物理提取法和化学提取法，在物理提取方法中包括有最为典型的热提法、高速离心法以及超声波法。在化学提取方法中包括有阳离子交换树脂提取法、氢氧化钠提取法、硫酸提取法以及edta提取法等。

4.无论是物理方法还是化学方法在提取后都必需一个高速离心的过程，从而将eps从细胞壁上取下来。对于不同的污泥来说，这一高速离心速度的选择是eps提取成功与否的关键因素。如果离心速度如果过高那么细胞壁容易破损，使得细胞内的物质溢出，污染收集的eps产品；如果离心速度过低，那么很难将包裹于细胞壁表面的提取胞外聚合物(eps)剥离下来。因此，对于本领域的技术人员而言，对于不同的污泥，在提取时必须谨慎地试验，获得满足需要的高速离心速度。

5.同时，在应用中，由于高速离心过程中需要的转速通常在/min左右，因此，尚有很多实验室不具备高速离心机的条件。

6.综上所述，研究污泥中提取eps的核心关键离心步骤，对于降低eps提取难度，提高eps提取方法的适用性具有重要的意义。

技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题包括污泥提取eps中高速离心步骤对离心条件的要求高，对不同污泥高速离心速度的选择繁复这两个问题。

8.为了解决上述技术问题，本发明公开了一种从污泥中提取eps的方法，包括以下步骤：

9.(1)将污泥预处理，使其满足eps提取需要；

10.(2)向预处理后的污泥中加入阳离子交换树脂，并在水浴条件下以100～/min的转速振荡；

11.(3)将经过步骤(2)处理后的溶液在/min条件下离心，取上清液；

12.(4)将上清液抽滤，滤液即为eps提取液。

13.进一步优选地，所述步骤(2)中水浴温度为80℃。

14.进一步优选地，所述步骤(2)中振荡时间为2小时。

15.在一个优选的技术方案中，所述步骤(2)中加入阳离子交换树脂的加入量为每1g污泥中加入60g阳离子交换树脂。

16.优选地，所述步骤(1)污泥预处理包括以下步骤：

17.(1-1)将污泥液离心，弃去上清液取下层；

18.(1-2)将离心得到的位于下层的污泥用提取缓冲液清洗。

19.优选地，所述步骤(1-1)中离心速度为/min。

20.在一个优选的技术方案中，所述步骤(4)中将上清液用0.45μm的醋酸纤维微滤膜抽滤。

21.本发明跳脱现有技术中物理提取与化学提取的固有模式，形成了一种具有普遍适用性的从污泥中提取eps的方法。由于在整个过程中不涉及高速离心，因此无需配备高速离心机等设备，极大降低了污泥中提取eps的成本，同时更为重要的是，由于在整个技术方案中不需要高速离心，因此不存在高速离心造成细胞壁破损的问题，从而无需针对不同菌种进行离心速度的摸索，极大地提高了从污泥中提取eps的操作性和便捷性。本发明在室温下即可操作，提取工艺简单，具有更高的工业化价值，同时经过对比发现，本发明的方法在絮凝污泥的eps提取中仍可以应用，且对有效成分定性相较于发酵方法测定更加准确。

附图说明

22.图1为实施例4中实验结果示意图。

23.图2为实施例7中实验结果示意图。

具体实施方式

24.为了更好的理解本发明，下面我们结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。

25.以下实施例中所加菌株均为自主筛选得到的菌株。

26.筛选方法如下：

27.1.絮凝菌筛选方法：

28.将样品富集培养后，采用平板稀释法和平板划线法得到单菌落，将纯化后的菌种编号，将以上得到的菌于30℃、摇床培养24h后对发酵菌液进行筛选。筛选分为初筛和复筛。

29.初筛方法：于50ml量筒内加入0.2g高岭土、1ml cacl2水溶液(1％)、1ml发酵液，然后加水至50ml，摇匀静止15min，同时以不加菌的培养基的高岭土悬浊液为对照，目测找出絮凝效果较好的菌株。

30.复筛：采用混凝试验来测定絮凝剂的絮凝活性。具体过程如下：在烧杯中加入高岭土悬浊液，其中一个加入不接种菌的培养基10ml作为对照，其余的加入10ml的发酵液。所有的烧杯中都加入1.水溶液(10％)作为助凝剂。用六联混凝搅拌器搅拌后静止20min，然后测定上清液的浊度，发酵液的絮凝活性通过下面的公式来计算：絮凝率(％)＝(a-b)

×

100/a

31.式中a———参照上清液的浊度

32.b———加入发酵液絮凝之后的上清液浊度

33.菌种鉴定：参照一般细菌常用鉴定方法，对筛选出的菌种进行生化和生理鉴定。

34.2.反硝化聚磷菌分离筛选方法：

35.菌株的分离方法：取10ml污泥至装有90ml无菌水三角瓶中加入玻璃珠将三角瓶放入空气振荡器中把污泥充分摇匀打碎。打碎后的污泥经倍比稀释，在牛肉膏蛋白胨培养基上采用混均平板法和平板划线法分离、纯化。

36.菌株的筛选方法：选取上述分离、纯化后所得斜面菌种，首先在缺磷的乙酸合成培养基中进行预培养，用1mol/l的氢氧化钠将ph值调到7.0。各培养物在30℃、的摇床上过夜培养。菌体细胞以1万转每分离心出来，之后用无菌蒸馏水洗涤，离心，重新悬浮于富磷培养基中，整个过程均在无菌操作台上进行；然后在30℃摇床中进行扩大培养，培养24h后，每种菌大约取10ml菌液，滤纸过滤取澄清的无菌液体培养基，利用钼锑抗分光光度法测定接种后po

4 3－

－p含量的变化。取吸磷率高于50％的菌株分别进行硝酸盐还原产气试验、异染颗粒染色和phb颗粒染色试验。

37.具有硝酸盐还原产气、且体内均含有phb颗粒或异染颗粒的菌株，可确认为高效反硝化聚磷菌。

38.实施例1

39.将絮凝菌加入絮凝污泥中，在反应器中运行反应，在运行中的絮凝反应器中取絮凝污泥。

40.然后按照以下方法对处理后的污泥进行eps提取。

41.(1)将污泥预处理，使其满足eps提取需要；

42.在本实施例中具体为包括以下两个步骤：

43.(1-1)取40ml污泥液离心，弃去上清液取下层；优选地，在本实施例中离心速度为/min；

44.(1-2)将离心得到的位于下层的污泥用提取缓冲液 清洗三次。

45.(2)向预处理后的污泥中加入阳离子交换树脂，并在水浴条件下以100～/min的转速振荡；在本实施例中优选地每1g污泥中加入60g阳离子交换树脂；进一步优选地，在本实施例中在80℃的水浴条件下以100～/min的转速震荡2h；

46.(3)将经过步骤(2)处理后的溶液在/min条件下离心，取上清液；

47.(4)将上清液抽滤，滤液即为eps提取液，优选地，在本实施例中上清液用0.45μm的醋酸纤维微滤膜抽滤，得到eps提取液。

48.实施例2阳离子树脂交换法

49.采用等量的与实施例1中具有相同絮凝菌的污泥，作为待提取污泥，并按照以下方法进行eps提取。

50.取40ml污泥混合液，于/min，4℃条件下15min离心，弃去上清液，加 反复冲洗，然后再/min离心5min，弃上清液，用 使污泥重新悬浮，于烧杯中。加入阳离子交换树脂(cer)，污泥与其比例为60g cer)/g vss，/min磁力搅拌2h(4℃条件下)，/min离心30min，将泥水分离，回收上清液再以同样的条件/min离心15min，保存上清液(全程离心机保持4℃)。将上清液用0.45μm的醋酸纤维微滤膜抽滤，滤液即为eps。

51.实施例3热解法

52.采用等量的与实施例1中具有相同絮凝菌的污泥，作为待提取污泥，并按照以下方法进行eps提取。

53.取40ml污泥混合液，于/min低速离心10min，弃去上清液，用 补足，使污泥悬浮，然后于/min低速离心机离心10min。操作重复三次，用蒸馏水将污泥清洗三次，最后用 补足至原体积，使污泥重新悬浮。于恒温水浴锅中在80℃的水浴条件热提10min后，于/min离心10min，取上清液。将上清液用0.45μm的醋酸纤维微滤膜抽滤，滤液即为eps。

54.实施例4

55.分别比较实施例1、实施例2、实施例3中提取得到的eps中的蛋白质含量和碳水化合物含量。

56.其中蛋白质含量采用lowry方法进行测定，以牛血清蛋白作为标准品；碳水化合物以硫酸蒽酮法进行测定，并以葡萄糖作为标准品。实验结果如图1所示，其中格子部分代表eps中蛋白质的含量，实体块部分代表碳水化合物含量。

57.如图1中所示，本发明所公开的方法对絮凝污泥进行eps提取，其蛋白质提取效果与现有技术中的热解法和阳离子树脂交换法效果相当，碳水化合物提取量与热解法几乎一样，与阳离子树脂交换法差别不大，说明本发明公开方法可以在低速离心条件下有效提取eps。

58.实施例5

59.将反硝化聚磷菌加入普通除磷脱氮污泥中，在反应器中运行反应，并在运行中的脱氮除磷反应器中，取脱氮除磷污泥。

60.然后按照以下方法对处理后的污泥进行eps提取。

61.(1)将污泥预处理，使其满足eps提取需要；

62.在本实施例中具体为包括以下两个步骤：

63.(1-1)取40ml污泥液离心，弃去上清液取下层；优选地，在本实施例中离心速度为/min；

64.(1-2)将离心得到的位于下层的污泥用提取缓冲液 清洗三次。

65.(2)向预处理后的污泥中加入阳离子交换树脂，并在水浴条件下以100～/min的转速振荡；在本实施例中优选地每1g污泥中加入60g阳离子交换树脂；进一步优选地，在本实施例中在80℃的水浴条件下以100～/min的转速震荡2h；

66.(3)将经过步骤(2)处理后的溶液在/min条件下离心，取上清液；

67.(4)将上清液抽滤，滤液即为eps提取液，优选地，在本实施例中上清液用0.45μm的醋酸纤维微滤膜抽滤，得到eps提取液。

68.实施例6阳离子树脂交换法

69.采用等量的与实施例5中具有相同反硝化聚磷菌的污泥，作为待提取污泥，并按照以下方法进行eps提取。

70.取40ml污泥混合液，于/min，4℃条件下15min离心，弃去上清液，加 反复冲洗，然后再/min离心5min，弃上清液，用 使污泥重新悬浮，于烧杯中。加入阳离子交换树脂(cer)，污泥与其比例为60g cer)/

g vss，/min磁力搅拌2h(4℃条件下)，/min离心30min，将泥水分离，回收上清液再以同样的条件/min离心15min，保存上清液(全程离心机保持4℃)。将上清液用0.45μm的醋酸纤维微滤膜抽滤，滤液即为eps。

71.实施例7热解法

72.采用等量的与实施例5中具有相同反硝化聚磷菌的污泥，作为待提取污泥，并按照以下方法进行eps提取。

73.取40ml污泥混合液，于/min低速离心10min，弃去上清液，用 补足，使污泥悬浮，然后于/min低速离心机离心10min。操作重复三次，用蒸馏水将污泥清洗三次，最后用 补足至原体积，使污泥重新悬浮。于恒温水浴锅中在80℃的水浴条件热提10min后，于/min离心10min，取上清液。将上清液用0.45μm的醋酸纤维微滤膜抽滤，滤液即为eps。

74.实施例8

75.分别比较实施例5、实施例6、实施例7中提取得到的eps中的蛋白质含量和碳水化合物含量。

76.其中蛋白质含量采用lowry方法进行测定，以牛血清蛋白作为标准品；碳水化合物以硫酸蒽酮法进行测定，并以葡萄糖作为标准品。实验结果如图2所示，其中格子部分代表eps中蛋白质的含量，实体块部分代表碳水化合物含量。

77.如图2中所示，本发明所公开的方法对普通除磷脱氮污泥进行eps提取，其蛋白质提取效果优于现有技术中的热解法和阳离子树脂交换法，同时碳水化合物提取量与热解法和阳离子树脂交换法几乎一样，说明本发明公开方法可以在低速离心条件下更加有效地提取eps。

78.特别要说明的是，在上述实施例中，我们已经优选出该菌株对应的阳离子交换法与热解法中的高速离心剥离过程中的适合转速，该转速分别为/min和8000r/min。由于这两种方案中所需的转速均在细胞壁破壁转速的附近，属于高速离心，因此当转速高于该转速时细胞破裂，污染收集的eps产品；当转速低于该转速时，不能达到剥离效果。但是，对于本发明中公开的6000r/min而言，由于其离心速度远达不到使细胞壁破壁的水平，属于低速离心，因此无需调整转速，使得方法具有普适性，无需繁复的转速调整操作。

79.以上所述是本发明的具体实施方式。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种从污泥中提取eps的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将污泥预处理，使其满足eps提取需要；(2)向预处理后的污泥中加入阳离子交换树脂，并在水浴条件下以100～/min的转速振荡；(3)将经过步骤(2)处理后的溶液在/min条件下离心，取上清液；(4)将上清液抽滤，滤液即为eps提取液。2.根据权利要求1所述的一种从污泥中提取eps的方法，其特征在于，所述步骤(2)中水浴温度为80℃。3.根据权利要求2所述的一种从污泥中提取eps的方法，其特征在于，所述步骤(2)中振荡时间为2小时。4.根据权利要求1所述的一种从污泥中提取eps的方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入阳离子交换树脂的加入量为每1g污泥中加入60g阳离子交换树脂。5.根据权利要求1所述的一种从污泥中提取eps的方法，其特征在于，所述步骤(1)污泥预处理包括以下步骤：(1-1)将污泥液离心，弃去上清液取下层；(1-2)将离心得到的位于下层的污泥用提取缓冲液清洗。6.根据权利要求1所述的一种从污泥中提取eps的方法，其特征在于，所述步骤(1-1)中离心速度为/min。7.根据权利要求1所述的一种从污泥中提取eps的方法，其特征在于，所述步骤(4)中将上清液用0.45μm的醋酸纤维微滤膜抽滤。

技术总结

本发明涉及一种从污泥中提取EPS的方法，包括污泥预处理，加入阳离子交换树脂，并在水浴条件下振荡，然后在/min条件下离心，取上清液的步骤，得到的上清液即为EPS提取液。本发明跳脱现有技术中物理提取与化学提取的固有模式，形成了一种具有普遍适用性的从污泥中提取EPS的方法。由于在整个过程中不涉及高速离心，因此无需配备高速离心机等设备，极大降低了污泥中提取EPS的成本，同时更为重要的是，由于在整个技术方案中不需要高速离心，因此不存在高速离心造成细胞壁破损的问题，从而无需针对不同菌种进行离心速度的摸索，极大地提高了从污泥中提取EPS的操作性和便捷性。提高了从污泥中提取EPS的操作性和便捷性。提高了从污泥中提取EPS的操作性和便捷性。

技术研发人员：常玉广 曹晶晶 刘景亮

受保护的技术使用者：南京晓庄学院

技术研发日：2021.10.18

技术公布日：2022/1/14