草履虫是原生动物的重要代表，也是初学者学习动物学时最先接触的动物。以草履虫为代表的纤毛虫在水体净化、监测方面有重要价值。本次实验主要介绍草履虫的净化及各种养殖方法，通过观察，掌握原生动物的基本特征，从而更好地了解有关原生动物的其他知识。

1. 实验准备

1.材料

干稻草、旧草席、干玉米穗、干荷叶、小麦粒、芹菜叶、干酵母、动物内脏（肝脏、胰腺、甲状腺等）、蛋黄、牛肉汤（牛肉50g，水100g，煮熟）。

（二）物资

显微镜、放大镜、电炉、恒温培养箱、载玻片、盖玻片、滴管、微量移液器、解剖针、烧杯、培养皿、凹面载玻片、纱布、吸水纸、大头针、琼脂、3％甲基纤维素溶液、碘溶液、葡萄糖、氯化钠、1％品红溶液、0.1％中性红溶液。

3. 采集与栽培

1. 收集

选择多个地点采集。对于富含有机物的废水，可现场采集250-500毫升水样，用放大镜检查。在显微镜下，凡是乳白色、大型、一端略圆、另一端略尖的圆柱形动物即为草履虫。如多次检查均未发现草履虫，则可丢弃水样，从其他地点采集。取回水样并在显微镜下检查后，凡含有草履虫的水样，应放在距离水样瓶10-20厘米处，用灯照射，照射24小时，使草履虫聚集在水的上层。

2. 培养基的制备

编写方法有多种，可根据实际教学需要选用。

（1）稻草培养基：干稻草10g，剪成3cm长，放入烧杯中，加水1000ml，煮沸10～15min，放冷，补充丢失的水分。在1000ml水处画一条刻度线，方便以后补充丢失的水分。

（2）玉米雄穗培养基：将15g干玉米雄穗剪成3cm长，加1000ml水，煮沸10～15分钟。

（3）荷叶培养基：干荷叶50g，撕碎，加水1000mL，煮沸15～20min。

（4）麦粒培养基：每100粒麦粒加1000mL水，煮沸10～15分钟。

（5）罗勒与稻草混合培养基：罗勒叶25g加水500ml，煮沸5分钟，补充丢失的水分后，加入500ml稻草培养基。

（6）干酵母培养基：将0.59%市售干酵母加入1000 mL水中，摇匀，备用。

（7）脏器培养基：动物内脏5克，剪成小块，加水1000毫升，浸泡1天，滤去内脏及残渣，留纯培养基。

（8）蛋黄培养基：煮熟蛋黄2g，加水1000ml，搅拌均匀。

（9）草席培养基：取旧草席10g，剪成3cm长，加水1000mL，再加入葡萄糖50g。

上述方法中，方法1至8，无论培养基是否煮沸，均需放入恒温箱中，在25-300℃下培养1-2天。目的是促使培养基中细菌生长，以便接种草履虫后，草履虫能以此为食。方法9不需煮沸培养基，也不需接种草履虫，直接将培养基放入恒温箱中培养。只要有草履虫孢囊附着在吸管上，当孢囊处于适宜的条件下，草履虫便会破孢而出，进行旺盛的代谢活动，在5-7天内大量繁殖。

3.栽培 下面介绍三种栽培方法。

（1）将采集的水样光照一昼夜后，用微量吸管从水面下1厘米处，即瓶壁上已形成一圈“白线”的地方取一滴液体，滴在载玻片上，经镜检确认水滴中只含草履虫，无其他微生物时，用新的干净滴管吸取培养液，将载玻片上的草履虫吹入培养瓶中，再置于25-300℃环境中培养5-7天，草履虫便会大量繁殖。

（2）若水样中含有少量其它微生物，可先在载玻片上滴一滴牛肉汁，再滴一滴含有草履虫的水样，两滴之间距离约2厘米。用解剖针从肉汁的一端画一条线至含有草履虫的水滴。待两滴连通后，用放大镜仔细观察，就会发现草履虫对牛肉汁十分敏感，草履虫游向牛肉汁滴的速度也很快。然后迅速将载玻片放在显微镜下检查。当确认牛肉汁滴中有其它微生物时，迅速用吸水纸剪断连接线，用纱布擦干另一侧的水滴，用干净的滴管将含有草履虫的牛肉汁吹入培养瓶中。重复此操作数次，然后将培养瓶置于25-300℃下继续培养。 经过5-7天，草履虫就会大量繁殖。

（3）若水样中混入的微生物种类和数量过多，不易消除，则需采用逐步扩大法。一般从水样中取液，滴1～2滴于凹面载玻片上，置于显微镜下观察，一边观察一边用微量吸管吸走其它微生物。当坑水中无其它微生物，仅含草履虫时，在坑内放入少量培养基，在25～300℃下培养，每天加入1/3～2/3培养基。若几天后草履虫数量增多，则将其转入观察皿或培养皿中继续扩大培养。若再过几天草履虫净化培养理想，数量又增多，则需将其转入大容器培养基中继续培养，直至大容器培养基中出现云状群落，显微镜下发现全部草履虫为止。

这里要特别指出的是，草履虫的培养可能会失败。造成这种情况的原因很多，其中主要有两点：一是接种的草履虫数量太少，个体质量差，进入新环境后，感觉不适，很快死亡，无法传递基因；二是稻草等材料发霉或残留农药过多，接种的草履虫可能中毒死亡，无法繁殖。因此，一旦发现培养基浑浊、有特殊气味，镜检未发现草履虫，应丢弃。为避免因培养失败而耽误教学工作，应多准备几瓶培养基，选择几种培养方法。

4. 种子保存

下面介绍三种种子保存方法。

（1）草履虫的培养观察实验结束后，即可将培养液收集起来，放在合适的环境中，不时加入1-2滴牛奶（或豆浆）以补充水分的流失。这些水样就是培养新草履虫的材料，使用起来非常方便。

（2）也可将剩余的培养基分别注入数个试管中，并按1：4的比例加入新的小麦籽粒提取物，用脱脂棉封住试管口，再将试管扎紧，用纱布包好，直立放入容器中，以便长期保存。

（3）也可以用较厚的干净纸片盖住剩余培养基的容器。随着时间推移，培养基会逐渐干涸，只剩下干稻草。实验前，只需在容器中加入冷开水，搅拌均匀，浸泡即可。以此浸泡液为接种材料，放入预先配制的新培养基中，在25-300℃的环境中培养。经过3-5天，就会出现新的草履虫。

2. 观察草履虫的方法和步骤

1. 草履虫对刺激的反应

取一滴水滴在干净的载玻片上。在水滴旁边滴一滴含有草履虫的培养液，在培养液远离水滴的边缘放一小段棉纤维，再在棉纤维末端抹上少许盐。然后用解剖针从水滴的一侧迅速抽向培养液滴，使二者连通。此时逐渐溶解的氯化钠顺着棉纤维桥慢慢进入培养液滴。由于氯化钠的刺激，草履虫立即产生强烈的躲避反应，一只只向水滴游去。

2. 草履虫的运动、消化和排泄细胞器的观察

1、第一种方法是将一滴草履虫培养液滴在载玻片上，再加入一滴3%甲基纤维素溶液，用大头针轻轻混匀，盖上载玻片。由于虫体处于相对致密的环境中，其运动受到很大限制，速度明显减慢。在低倍显微镜下很容易找到最慢的，将其移到视野中央，换到高倍显微镜下观察。会看到虫体呈倒置的凉鞋状，口沟明显，遍布全身的纤毛缓慢摆动，咽部振荡膜快速运动。体内有大量的食物泡随细胞质流动。如果我们盯着虫体的一端看，会看到放射状的收集管和位于其中间的收缩泡交替扩张和收缩。用此方法观察最好在20分钟内完成，否则虫体会变形、解体。 如果观察未完成，则需要制作新的幻灯片。

制片时，为了能显示出食物泡，可用玻璃棒蘸取少量1%品红溶液和0.1%中性红溶液放入培养基中混匀，静置3～5分钟，再加入3%甲基纤维素溶液。制片后在显微镜下可见大小不一的红色食物泡，随着草履虫体内细胞质的流动而流动。

2、第二种方法是将培养液与染液在载玻片上混合均匀，然后在滴的右侧放一根略长于载玻片宽度的毛发，与载玻片长边垂直，再盖上盖玻片，使毛发的上下端刚好露出载玻片外面。取一小块吸水纸，沿有毛发的一侧的盖玻片边缘吸水，直至盖玻片下的水大部分被吸收，没有水分流失为止。此时用左手轻压盖玻片，用右手轻轻拉出毛发，使载玻片与盖玻片通过剩余的极少量水分紧紧贴在一起。在低倍显微镜下观察，会看到在放毛发的地方有很多草履虫堵塞，并被盖玻片压平。找出其中移动最慢的一只，换用高倍显微镜继续观察。

大核的观察

在载玻片上滴一滴培养液，加少许碘溶液混匀，盖上载玻片，在低倍显微镜下观察，会发现死去的草履虫体内中央有一个很大的肾形结构，这就是草履虫的大细胞核。

（四）草履虫接合现象观察

据研究，每种草履虫都有不同的繁殖群，每个繁殖群的交配类型也不同，只有同一繁殖群内不同的交配类型才能结合繁殖。过去，将含有生长旺盛的草履虫的培养基离心，去掉培养基，用自来水稀释，每隔一段时间观察一次结合现象。有时结合率过低的主要原因是它们大多分属于不同的繁殖群，不会结合。只有少数草履虫在同一繁殖群内分属于不同的交配类型，所以很少观察到结合现象。为避免上述结合率过低的现象，应将多地采集的草履虫分别纯化培养，并编号，不要混放。当草履虫生长旺盛势头达到顶峰，培养液开始变清澈时，表明草履虫已经饱食，即将转入饥饿状态。 此时可将各培养液逐一离心，再将浓缩后的草履虫按序号成对混合，置于20-250C环境中，每隔1小时观察一次。若发现某一群草履虫发生结合，且配对较多，则说明为同一养殖群内两种相对结合型。以后只要将两种相对结合型分开养殖，持续提供充足食物，保持其旺盛生长，随时取样混合，草履虫便会立即或数小时内结合繁殖。